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Int J Neurosci,6 Human anterior and frontal midline theta and lower libro vipassana próstata coleman 2020 reflect emotionally positive state and internalized attention: highresolution EEG investigation of meditation. Neurosci Lett, 1 Linear and non-linear concomitants of altered state of consciousness during meditation: high resolution EEG investigation.

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Int J Psychophysiol, 45 1—2 Non-linear dynamic complexity of the human EEG during meditation. Neurosci Lett, 2 Changes in cortical activity in altered states of consciousness: the study of meditation by high-resolution EEG. J Hum Physiol, 29 2 Aghajanian G. Serotonin and hallucinogens.

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El tampn de electroforesis que se utiliz libro vipassana próstata coleman 2020 compuesto por Tris 25 mM, pH 8.

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Finalizada la transferencia, para bloquear los sitios de unin inespecficos a la membrana, sta se incub durante 1 h y 30 min a temperatura ambiente con tampn Libro vipassana próstata coleman 2020 al 0. Posteriormente, las membranas se incubaron con el anticuerpo primario especfico de la protena a estudiar, diluido con el mismo tampn, durante toda la noche a 4 C.

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Se realizaron dos lavados rpidos de las membranas y se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con peroxidasa durante 1 h a temperatura ambiente. Tras un breve tiempo de exposicin, se revelaron las autoluminografas. Los datos se refieren a la cantidad de tubulina, utilizada como control libro vipassana próstata coleman 2020 carga de cada pocillo. Materiales y Mtodos 62 2.

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En este caso tambin se comprob mediante el programa BLAST que no afectaban a ningn gen del genoma humano. Primero se diluyeron los oligonucletidos del libro vipassana próstata coleman 2020 especfico en medio Optimen Invitrogen, Paisley, UK al que posteriormente se aadi una solucin de Optimen libro vipassana próstata coleman 2020 lipofectamina Invitrogen, Paisley, UK y la mezcla se incub durante 20 min a temperatura ambiente.

Despus de la transfeccin, las clulas se dejaron crecer en condiciones normales durante 48 72 Materiales y Mtodos libro vipassana próstata coleman 2020 h segn el experimento, para permitir la inhibicin de la expresin de la protena. Posteriormente se realizaron los tratamientos correspondientes. Tras los distintos tiempos de tratamiento de las clulas, se retir el medio y se aadi 1ml de TriReagent TM por cada placa P El lisado resultante se pas a un tubo de 1. Se recogi cuidadosamente la fase acuosa y se aadi 0.

Finalmente el precipitado se sec y se resuspendi en agua libre de RNAsas. A continuacin se determin la cantidad y la calidad del RNA midiendo la absorbancia de la muestra a nm y nm.

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Adems se analiz su integridad mediante electroforesis en gel de agarosa. Agua DEPC: 2. Materiales y Libro vipassana próstata coleman 2020 64 El volumen final de la reaccin fue de 25 l.

Las bandas se observaron por la exposicin a la luz U. La cuantificacin relativa de los genes libro vipassana próstata coleman 2020 inters se calcul usando el mtodo de comparacin de libro vipassana próstata coleman 2020 valores Ct ciclo umbraldnde Ct se define como el nmero de ciclo a partir del cual el producto es detectado por fluorescencia o el ciclo a partir del cual comienza la amplificacin de manera exponencial.

Para ello se us la siguiente frmula: 2 -Ct Siendo Ct igual a Ct muestra problema menos Ct muestra control y Ct, la diferencia entre Ct obtenido en la amplificacin del gen objeto de estudio en la muestra y un gen constitutivo de la misma muestra frente al cual se normaliza la cuantificacin, en este caso el gen de la actina. Consta de cuatro pasos diferentes que se desglosan a continuacin. Se centrifugaron a g a 4 C. Materiales y Mtodos 66 2.

Se tomaron l de sobrenadante que se incub con 1 g de anticuerpo anti NFB p65 durante toda la noche a 4 C. La unin protena-DNA se revirti incubando los sobrenadantes a Adelgazar 50 kilos C toda la noche.

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En este punto tambin se incub el control. Se recogi la fase acuosa y se precipit aadiendo 0. Se utilizaron oligonucletidos correspondientes a una secuencia de unin a NFB del libro vipassana próstata coleman 2020 de IL-6, previamente descrita Shimizu et al.

Al no poseer timo o ser este rudimentario, estos animales tienen una deficiencia de clulas T Pantelouris, presentando una falta de respuesta inmune dependiente del timo, lo que permite que puedan ser receptores de tumores libro vipassana próstata coleman 2020. Aproximadamente a las 4 semanas el tumor alcanz un tamao de 70 mm 3.

Los ratones fueron divididos en 3 grupos experimentales Adelgazar 40 kilos 8 animales cada uno, los cuales recibieron los siguientes tratamientos diariamente con inyecciones subcutneas: grupo A, salino control ; grupo B, 1.

Para preparar la solucin de inyeccin, los compuestos fueron inicialmente disueltos en etanol a una concentracin de 25 mM de JWH y La inyeccin fue repetida diariamente en un tratamiento continuado durante 15 das y el peso de los ratones fue medido cada da.

El volumen del tumor se midi con un calibrador y fue calculado con la formula 4n 3 [ libro vipassana próstata coleman 2020 2 2 L 2 2siendo W el ancho del tumor y L la longitud del mismo.

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Los valores estn indicados como la media error estandar. Para ello se trataron las clulas PC-3 durante distintos tiempos con ambos cannabinoides a concentracin 10 M y se valor la viabilidad celular por ensayo MTT. El MTT es un ensayo colorimtrico que determina la actividad metablica de las clulas valorando su capacidad para reducir la sal libro vipassana próstata coleman 2020 tetrazolio MTT a un compuesto de color azul oscuro denominado formazn, por las deshidrogenasas mitocondriales en las clulas vivas Slater et al.

As pues, este ensayo permite libro vipassana próstata coleman 2020 la viabilidad celular.

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En la figura 17 vemos la cintica del tratamiento, que muestra una disminucin de la viabilidad celular a partir de las 12 h, aunque el efecto mximo se da a las h. A la vista de libro vipassana próstata coleman 2020 datos se continu el estudio usando 48 h como tiempo ptimo de tratamiento.

Como se observa en la figura 18, existe una respuesta dependiente de la dosis de cannabinoides, disminuyendo la viabilidad celular de forma significativa a dosis del orden micromolar, de nuevo de forma ms acusada con la MET. En el caso del 72 Figura Una vez finalizado el ensayo se procedi a medir la cantidad de tritio incorporado en las clulas. En la figura 19 vemos que los libro vipassana próstata coleman 2020 inducen un efecto sobre la proliferacin celular dependiente de la dosis, aumentando sta libro vipassana próstata coleman 2020 dosis del orden bien documentado Pacher et al.

A Adelgazar 30 kilos de la dosis 10 M, sin embargo, se observ una inhibicin total del crecimiento. B Las clulas PC-3 fueron incubadas con distintas concentraciones de JWH durante 48 h y la viabilidad celular fue medida por incorporacin de [ 3 H]-timidina.

Para caracterizar este efecto citosttico de los cannabinoides se ti el DNA de las clulas jo.

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Para llevar a cabo este anlisis, las clulas se incubaron con dosis crecientes de MET o JWH libro vipassana próstata coleman 2020 48 h y posteriormente se analiz el ciclo celular por citometra de flujo. A Las clulas PC-3 fueron incubadas con distintas concentraciones de MET durante 48 h y se analiz el ciclo celular por citometra de flujo tal y como se describe en Materiales y Mtodos.

Libro vipassana próstata coleman 2020 Las clulas PC-3 fueron incubadas con distintas concentraciones de JWH durante 48 h y se analiz el ciclo celular por citometra de flujo. La prdida de la asimetra de la membrana plasmtica es uno de los eventos pranos del proceso apopttico.

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Cuando ocurre, se producen cambi es La buena dieta protena marcada con un fluorforo, que presenta afinidad por la fosfatidil libro vipassana próstata coleman 2020, permitiendo la cuantificacin de clulas apoptticas. Las clulas que han perdido la integridad de membrana tambin se tien con IP, pudiendo discriminar as entre clulas en proceso de apoptosis temprana, cuando nicamente unen anexina y clulas en apoptosis tarda, cuando unen tanto anexina como IP.

En la figura 21 observamos que slo se obtuvieron cambios significativos en la apoptosis tarda cuadrante superior libro vipassana próstata coleman 2020a partir de la dosis 10 M. Cuando las clulas entran en apoptosis suele ocurrir una condensacin del DNA y posteriormente ste se fragmenta de forma controlada formando los llamados cuerpos apoptticos Robertson et al. Como vemos en la figura 22, al tratar las clulas con MET 10 M o JWH libro vipassana próstata coleman 2020 M se observaron cambios en la morfologa y tamao nuclear, existiendo mayor condensacin de la cromatina, as como ncleos de mayor tamao que en las clulas no tratadas con cannabinoides, pero no se lleg a detectar la presencia de cuerpos apoptticos, ni a las 48h ni a las 72 h de tratamiento.

Resultados 76 a vez conocido el efecto de MET y JWH sobre las clulas PC-3, nos planteamos si ste sera generalizado sobre otras clulas tumorales de prstata.

Se usaron otras dos lneas de cncer de prstata, la lnea celular andrgeno independiente DU y la andrgeno dependiente LNCaP. En la figura 23 vemos que ambos libro vipassana próstata coleman 2020 inhiben el crecimiento de todas las lneas, pero el efecto es menos pronunciado en la lnea LNCaP, que representa un cncer libro vipassana próstata coleman 2020 prstata menos agresivo.

Con ambos cannabinoides la disminucin de la viabilidad es ms acusada en las dos lneas ms agresivas, PC-3 y DU Las clulas fueron incubadas con 10 M de MET o JWH durante 48 h panel superior o 72 h panel inferiory transcurrido estos tiempos se tieron con DAPI tal y como se describe en Material y Mtodos y se observaron por microscopio de fluorescencia.

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La imagen es representativa de dos experimentos independientes realizados por triplicado. Resultados 77 2. Como se observa en la figura 24, slo se obtuvo una inhibicin parcial de la disminucin de la viabilidad libro vipassana próstata coleman 2020 al pretratar las clulas con SR2. Al ser este cannabinoide agonista selectivo del receptor de cannabinoides CB2, estudiamos nicamente la posible implicacin de este receptor. Para ello se seleccion la dosis 10 M de JWH durante 48 h y se pretrataron las clulas con libro vipassana próstata coleman 2020 antagonista Figura Transcurrido este tiempo la viabilidad celular se midi por MTT tal y como se describe en Materiales y Mtodos.

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SR2 inhibi de forma significativa la disminucin de la viabilidad celular producida por JWH figura Implicacin del receptor de cannabinoides CB2 en la muerte celular lar en Materiales y Mtodos. Transcurrido este tiempo la viabilidad celu se midi libro vipassana próstata coleman 2020 MTT tal y como se describe E.

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Para confirmar el papel de los receptores de cannabinoides se llev a cabo un anlisis por citometra de flujo de la apoptosis y del ciclo celular en las clulas pretratadas con los antagonistas. Como se observa en la figu Figura Inhibicin por SR2 de libro vipassana próstata coleman 2020 apoptosis inducida por cannabinoides.

Como se puede observar en la figura 24, al silenciar CB2 se consigui revertir la apoptosis inducida por el tratamiento con JWH, lo que confirmaba el que el efecto antiproliferativo de JWH se produca a travs de CB2. Para ello se transfectaron las clulas con un siRNA selectivo del receptor de cannabinoides CB2 metastasis de prostata con una secuencia de RNA con pares de bases desordenada que no hibrida con ninguna secuencia del genoma scrambleddurante 72 h, consiguiendo inhibir notablemente la expresin del receptor CB2 figura Relevancia del receptor de cannabinoides Libro vipassana próstata coleman 2020 en el efecto producido por los cannabinoides en clulas PC Apoptosis 2.

Con el fin de estudiar si este segundo mensajero estaba implicado en el efecto antiproliferativo de los cannabinoides, en primer lugar se trataron las clulas durante 48 h con distintas dosis de MET o JWH y se cuantificaron los niveles de ceramida intracelular. El tratamiento con MET y JWH libro vipassana próstata coleman 2020 un incremento significativo de los niveles de ceramidas intracelulares figura Con D se obtuvo una ligera reversin, pero no fue estadsticamente significativa figura Por lo tanto, el aumento de ceramida se produca fundamentalmente por sntesis de novo, aunque la degradacin de esfingomielina de la membrana plasmtica tambin podra participar en este aumento.

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La ceramida puede generarse a travs de dos rutas: por sntesis de novo a partir de la condensacin de palmitoil libro vipassana próstata coleman 2020 A y serina del retculo endoplasmtico, formando esfinganina, que es convertida en ceramida por la enzima ceramida sintasa, o bien por degradacin de esfingolmielina de la membrana plasmtica por diferentes esfingomielinasas Malagarie-Cazenave et al. Para estudiar cul de las dos rutas estaba implicada en el aumento de ceramidas inducido por los cannabinoides, se pretrataron las clulas con dos inhibidores de ambas rutas: D, que inhibe la degradacin de esfingomielina y fumonisina B1 Fumoque inhibe la ceramida sintasa.

Libro vipassana próstata coleman 2020 sntesis de ceramidas se produce a travs de la ruta de novo. Transcurrido este tiempo se midieron los niveles de ceramidas intracelulares por el mtodo de DAG quinasa tal y como se describe en La buena dieta y Mtodos.

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Hasta ahora habamos observado que los cannabinoides inducan un efecto antiproliferativo y pro-apopttico en las clulas PC-3 y que tambin eran capaces de provocar un aumento en la sntesis de novo de ceramida.

Con el fin de investigar si la ceramida perdiendo peso involucrada en el efecto omo por JWH Por lo tanto, la sntesis de ceramida estaba implicada en la disminucin de la viabilidad inducida por los cannabinoides. Para estudiar la implicacin de los receptores de cannabinoides en la sntesis de ceramida, medimos los niveles de sta en presencia de o slo con SR2 en el caso de JWH C e le receptor CB2 era el responsable del aumento de ceramida producido por libro vipassana próstata coleman 2020 cannabinoides.

Con MET tambin libro vipassana próstata coleman 2020 obtuvo una disminucin de los niveles de ceramida al preincubar con los antagonistas del receptor de cannabinoides CB1 y del receptor de v antiproliferativo y pro-apopttico de los cannabinoides, se llev a cabo un estudio de la viabilidad celular pretratando a las clulas con fumonisina B1. Implicacin del receptor CB2 en la sntesis de ceramida.

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Resultados 84 Se continu estudiando el efecto de la ceramida sobre los cambios producidos por los cannabinoides en el ciclo celular. Libro vipassana próstata coleman 2020 ello se preincubaron las clulas con fumonisina B1 libro vipassana próstata coleman 2020 30 min y posteriormente con JWH 10 M durante 48 h.

En la figura 32 vemos que la fumonisina B1 revierte el aumento de clulas apoptticas producido por JWH sin afectar a las distintas fases del ciclo celular, por tanto la ceramida participaba en el efecto pro-apopttico de los cannabinoides en las clulas PC The immortals book series movie. Bizim emlak mus. Blur text effect indesign.

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El libro vipassana próstata coleman 2020 mitognico de los cannabinoides parece ocurrir a travs de la sealizacin dependiente de cAMP y por modulacin de la expresin del AR Sanchez et al.

La invasin tumoral tambin puede ser inhibida por los cannabinoides a travs de CB1 Nithipatikom et al.

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Por otra parte los cannabinoides inducen la secrecin de diferentes citoquinas, promoviendo tanto efectos pro-inflamatorios como anti-inflamatorios que modulan la hematopoyesis y el crecimiento tumoral Pacher et al. El papel del sistema inmune en el control del desarrollo del cncer tambin es clave, como demuestra el hecho de que los individuos inmunodeprimidos tengan mayor riesgo de desarrollar cncer Oruc et libro vipassana próstata coleman 2020.

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En este sentido, los cannabinoides pueden ser especialmente importantes, ya que se conocen bien sus efectos inmunorreguladores, modulando distintos componentes del sistema inmune Klein, ; Tanasescu et al. Una de las respuestas que stos inducen sobre el sistema inmune Introduccin 43 es la inmunosupresin, lo que podra provocar una tolerancia al tumor, que implicara un riesgo derivado del uso teraputico de los cannabinoides Klein, A pesar de esto, existen pocas evidencias que relacionen los cannabinoides con una respuesta protumoral, y se cree que la capacidad intrnseca del tumor de responder a los cannabinoides es crtica para resolver el balance entre tolerancia al tumor y respuesta antitumoral y, en consecuencia, entre progresin y regresin del cncer.

Cuando el tumor es capaz de responder a los cannabinoides, tanto libro vipassana próstata coleman 2020 tumor como las clulas inmunes son dianas de los cannabinoides, producindose una regresin tumoral. Cuando el tumor no responde a libro vipassana próstata coleman 2020 cannabinoides, podra prevalecer el efecto inmunosupresor, desarrollndose una tolerancia al tumor que permite el crecimiento tumoral o neoplasia Flygare et al.

An as, son muchos ms los estudios que revelan un claro papel antitumoral de los cannabinoides, no libro vipassana próstata coleman 2020 a travs de la induccin de apoptosis y parada de ciclo celular, si no regulando otros muchos procesos involucrados en el desarrollo y progresin del cncer, como inhibicin de angiognesis e invasin tumoral Ramer et al.

La capacidad de los cannabinoides de modular el sistema inmune libro vipassana próstata coleman 2020 podra estar relacionada con este papel antitumoral, ya que los cannabinoides son capaces de inducir migracin clínica de dolor pélvico crónico diferenciacin celular, especialmente en los linfocitos T Pisanti et al. Todas estas reacciones seran susceptibles de ser empleadas para lanzar respuestas celulares contra el tumor Ribeiro et al.

Es ms, se ha demostrado que los cannabinoides influyen en la diferenciacin de los linfocitos T a travs del receptor CB2 Yuan et al. Por tanto, los cannabinoides podran regular la homeostasis del sistema inmune fundamentalmente a travs del receptor CB2, modulando la secrecin de citoquinas libro vipassana próstata coleman 2020 influyendo en la diferenciacin, migracin y proliferacin de las clulas inmunes y al mismo tiempo resultaran antitumorales efectivos, pudiendo el receptor CB2 servir de unin entre el sistema inmune y la respuesta antitumoral Cabral et al.

Aunque en su fase andrgeno dependiente responde libro vipassana próstata coleman 2020 al tratamiento por privacin andrognica, la enfermedad suele recurrir desarrollando una resistencia a esta ablacin hormonal.

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Mientras el tumor est localizado, puede tratarse por extirpacin de la prstata prostatectoma o radioterapia, pero cuando la neoplasia est ms avanzada y es capaz de metastatizar no existe libro vipassana próstata coleman 2020 tratamiento eficaz y la libro vipassana próstata coleman 2020 de supervivencia de estos pacientes es muy reducida. El tratamiento actual para estos pacientes es la quimioterapia con agentes citotxicos. Pero hasta ahora slo se logra aumentar su supervivencia unos meses, siendo de hecho la metstasis de prstata la segunda causa de muerte en el varn.

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En este sentido se ha mostrado en numerosos tipos de cncer que los cannabinoides afectan a muchos de los procesos celulares implicados en el desarrollo del tumor, presentando una gran variedad de efectos anticancergenos. Adems, en el cncer de prstata se expresan varios componentes del sistema libro vipassana próstata coleman 2020, entre ellos los receptores de cannabinoides Ruiz-Llorente et al.

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Por libro vipassana próstata coleman 2020 ello nos propusimos estudiar el efecto de los cannabinoides en las clulas tumorales de cncer de prstata PC-3, analizando su mecanismo de accin. Con este fin se propusieron los siguientes objetivos: 1. Hiptesis y Objetivos 48 3. Louis, USA. Medio Keratinocyte-SFM suplementado con extracto de pituitaria bovina 0.

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Materiales y Mtodos 52 Cloroformo, acetona, cido perclrico y cido actico de Sigma St. Capsacepina procede de Tocris Bristol, UK. El inhibidor de ceramida sintasa, fumonisina B1, procede de Sigma St.

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La lnea LNCaP, proviene de una metstasis a un ganglio linftico de un carcinoma prosttico, responde a andrgenos, y por tanto representa el estadio 1 de la enfermedad. Es insensible a andrgenos, por lo que se usa como modelo de la fase dos de la enfermedad. La lnea DU proviene de una metstasis cerebral de libro vipassana próstata coleman 2020 carcinoma prosttico. Al igual que la lnea PC-3 no presenta sensibilidad a andrgenos.

Y la lnea RWPE-1 se utiliza como control no tumoral. Posteriormente, este precipitado se solubiliz con isopropanol cido, se agitaron suavemente las placas para obtener una coloracin homognea y se valoraron las absorbancias a nm y a nm con un libro vipassana próstata coleman 2020 de placas ELX Bio-Tek Intruments, INC. Materiales y Mtodos 54 2.

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Posteriormente se recogi el medio de incubacin, se adicion 2 ml de lquido de centelleo Optiphase Hisafe 3 de Wallac Turku, Finlandia La buena dieta se valor la cantidad de [ 3 H] presente en cada vial con un contador de centelleo lquido Wallac Guardian Liquid Scintilliation Counter.

Los datos obtenidos se expresan como desintegraciones por minuto dpm. Una vez realizados los tratamientos se tripsinizaron y centrifugaron a g durante 5 libro vipassana próstata coleman 2020. Los porcentajes de las clulas en diferentes fases del ciclo celular, as como las clulas hipodiploides sub G1que corresponden a clulas muertas, se calcularon a partir de los histogramas de contenido de DNA, utilizando el programa WinMDI 2. Se libro vipassana próstata coleman 2020 las clulas en placas de seis pocillos con una densidad de 2 x10 5 clulas por pocillo.

Posteriormente se aadieron l de tampn de unin fro y seguidamente se analizaron las muestras mediante citmetro FACSCalibur de Becton Dickinson.

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Tras el tratamiento, los cubreobjetos se lavaron 3 veces en PBS y se fijaron las clulas con paraformaldehdo 3. Al finalizar los tratamientos, las clulas se rasparon con PBS se centrifugaron a g durante 5 min.

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Se retir el PBS y se congel el sedimento a 80 C. Posteriormente se aadi un volumen de l de agua destilada a cada muestra, se resuspendi el sedimento y se sonicaron las muestras durante 10 s a temperatura ambiente. La libro vipassana próstata coleman 2020 se realiz en libro vipassana próstata coleman 2020 volumen de l, dejando el resto para la valoracin de la concentracin de protenas totales. Se aadieron 2. Materiales y Mtodos 56 Se recogi la fase inferior donde se encuentran los lpidos celulares y posteriormente estas muestras fueron evaporadas con nitrgeno gaseoso para evitar la oxidacin lipdica.

Las muestras se guardaron a C hasta su valoracin. Posteriormente se aadi la enzima DAG quinasa de E.

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Las muestras se separaron por cromatografa en capa fina TLC. Al finalizar la TLC, los lpidos se localizaron por exposicin a una pelcula radiogrfica, durante toda la noche. Despus de revelar la pelcula, las bandas correspondientes a la ceramidafosfato fueron raspadas y se valor la cantidad de [ 32 P]ATP incorporado mediante la adicin de libro vipassana próstata coleman 2020. La cantidad de ceramida se calcul en picomoles pmol refiriendo las cpm a un control interno.

Los datos se expresan como porcentaje de pmol de ceramida por mg de protena de la muestra.

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Materiales y Mtodos 57 2. Se sembraron las clulas en placas de 24 pocillos a una densidad de 1x10 4 clulas por pocillo. Tras los diferentes tratamientos, los sobrenadantes celulares fueron recogidos y diluidos en PBS. Se incubaron los sobrenadantes celulares durante una hora en una placa de 96 pocillos Libro vipassana próstata coleman 2020 Nunc TMRoskilde, Dinamarcapreviamente cubierta con anticuerpo anti-IL-6 humana.

Libro vipassana próstata coleman 2020 lavar la placa con PBS conteniendo 0. Se lav la placa con PBS-Tween y se incub con la enzima peroxidasa de rbano HRP conjugada con estreptavidina durante 20 min a temperatura ambiente. En algunos de los ensayos se emple IL-6 recombinante de humano procedente de Prepotech Paris, France.

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La muestra de sangre se diluy con suero fisiolgico y se pipete cuidadosamente medio volumen de Lymphoprep TM compuesto por ficoll y metrizoato sdico en la base de esta dilucin, de forma que se gener un lecho de Lymphoprep libro vipassana próstata coleman 2020 el que descansaba la sangre diluida. Se obtuvo de esta libro vipassana próstata coleman 2020 un gradiente de ficoll en el que se distribuyeron las clulas sanguneas atendiendo a su diferente densidad.

Las clulas mononucleares fueron sometidas a distintos tratamientos, tras lo cual los sobrenadantes celulares fueron recogidos y congelados.

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Se incubaron los sobrenadantes celulares durante dos horas en una placa de 96 pocillos MaxiSorp Nunc TMRoskilde, Dinamarcapreviamente cubierta con anticuerpo anti-IL humana. Inmediatamente despus las muestras fueron centrifugadas libro vipassana próstata coleman 2020 g durante 1 h y 30 min a 4 C y posteriormente se recogi, por una parte el sobrenadante que libro vipassana próstata coleman 2020 a la libro vipassana próstata coleman 2020 soluble y por otra el sedimento que corresponde a la fraccin particulada.

El sedimento se resuspendi en tampn de homogeneizacin A y se homogeneiz por pipeteo o sonicacin. Ambas fracciones se almacenaron a 80 C hasta su utilizacin. Materiales y Mtodos 59 2. El precipitado se lis con l de tampn de lisis A con NP 0. El sobrenadante se recolect como extracto nuclear. Posteriormente, las muestras recogidas se dejaron a 4 C durante al menos 30 min.

Materiales y Mtodos 60 2. El tampn de electroforesis que se utiliz estaba compuesto por Tris 25 mM, pH 8. Finalizada la transferencia, para bloquear los sitios de unin inespecficos a la membrana, sta se incub durante 1 h y 30 min a temperatura ambiente con tampn PBS-Tween al 0. Posteriormente, las membranas se incubaron con el anticuerpo primario especfico de la protena a estudiar, diluido con el mismo tampn, durante toda la noche a 4 C.

Se realizaron dos lavados rpidos de las membranas y se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con peroxidasa durante 1 h perdiendo peso temperatura ambiente. Tras un breve tiempo de exposicin, libro vipassana próstata coleman 2020 revelaron las autoluminografas. Los datos se refieren a la cantidad de tubulina, utilizada como control de carga de cada pocillo. Materiales y Mtodos 62 2. En este caso tambin se comprob mediante el programa BLAST que no afectaban a ningn gen del genoma humano.

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Primero se diluyeron los oligonucletidos del gen especfico en medio Optimen Invitrogen, Paisley, UK al que posteriormente se aadi una solucin de Optimen ms lipofectamina Invitrogen, Paisley, UK y la libro vipassana próstata coleman 2020 se incub durante 20 min a temperatura ambiente. Despus de la transfeccin, las clulas se dejaron crecer en condiciones normales durante 48 72 Materiales y Mtodos 63 h segn el experimento, para permitir la inhibicin de la expresin de la protena.

Posteriormente se realizaron los tratamientos correspondientes. Tras los distintos tiempos de tratamiento de las clulas, se retir el medio y se aadi 1ml de TriReagent TM por cada placa P El lisado resultante se pas a un tubo de 1.

Se recogi cuidadosamente la fase acuosa y se aadi 0. Finalmente el precipitado se sec y libro vipassana próstata coleman 2020 resuspendi en agua libre de RNAsas.

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A continuacin se determin la cantidad y la calidad del RNA midiendo la absorbancia de la muestra a nm y nm. Adems se analiz su integridad mediante electroforesis en gel de agarosa. Agua DEPC: 2.

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Materiales y Mtodos 64 El volumen final de la reaccin fue de 25 l. Las bandas se observaron libro vipassana próstata coleman 2020 la exposicin a la luz U. La cuantificacin relativa de los genes de inters se calcul usando el mtodo de comparacin de los valores Ct ciclo umbraldnde Ct se define como el nmero de ciclo a partir del cual el libro vipassana próstata coleman 2020 es detectado por fluorescencia o el ciclo a partir del cual comienza la amplificacin de manera exponencial.

Para ello se us la siguiente frmula: 2 -Ct Siendo Ct igual a Ct muestra problema menos Ct muestra control y Ct, la diferencia entre Ct obtenido en la amplificacin del gen objeto de estudio en la muestra y un gen constitutivo de la misma muestra frente al cual se normaliza la cuantificacin, en este caso el gen de la actina.

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Consta de cuatro pasos diferentes que se desglosan a continuacin. Se centrifugaron a g a 4 C. Materiales y Mtodos 66 2.

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